摘要：与老龄化相关的慢性退行性疾病的整体发病率增加使得伤口治疗成为极大的社会经济负担。因此，开发新的伤口治疗方法以改善伤口愈合的需求不断增加。再生治疗的应用因其低侵入性而变得越来越受人青睐。富含血小板血浆（PRP）因为其刺激和促进伤口愈合的潜力而备受关注。PRP中的细胞因子和生长因子在愈合过程中可发挥关键作用。本文将对新的伤口再生治疗方法进行综述，尤其是关于PRP和生长因子在伤口愈合过程中的作用。
1. 介绍
PRP是一种内源性的治疗手段，由于其在刺激和促进组织愈合方面的潜力，获得了越来越多的关注。PRP是一种直接从患者血液获得的自体生物产品，全血经过离心过程后提取出血小板浓度高于循环血液的血浆。血小板不仅具有凝血功能，而且富含细胞因子和生长因子，在组织愈合中扮演了关键角色。已知参与伤口愈合过程的生长因子包括血小板来源生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF1, IGF2）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF-b）、角质细胞生长因子（KGF）（图1）。
图1: 参与伤口愈合过程的生长因子和细胞因子
到目前为止，只有PDGF被美国FDA和欧洲官方批准用于临床治疗。生长因子是一组具有水溶性和可扩散的多肽物质，可调节多种细胞的生长、分化、增殖和细胞代谢。其可促进内皮和表皮再生，刺激血管生成、胶原蛋白合成、软组织愈合和止血。
使用生长因子来促进皮肤伤口愈合的历史可以追溯到上世纪40年代，其应用有多种方法，包括传统的局部或创面内应用、或使用特殊的支架或甚至是基因治疗。已有很多报道PRP成功用于治疗动物和人体的慢性皮肤溃疡、急性皮肤伤口、烧伤和整形及美容手术。
针对皮肤伤口再生治疗方法如PRP和干细胞的体内和体外临床和实验性研究取得了令人鼓舞的结果。本文将对皮肤伤口再生治疗尤其是PRP进行全面介绍。
2. 伤口愈合阶段
对伤口愈合病理生理机制的深入理解显著提高了伤口的临床诊疗水平。伤口愈合是多细胞生物中最复杂的过程之一，涉及多种细胞内和之间的众多信号传递。以伤口修复为主要目标的生物过程中有物理、化学和细胞因子的参与。
皮肤伤口的愈合机制可分为修复（Repair）或再生（Regeneration），两种类型的愈合有着清晰和重要的区别。伤口修复中的新生组织的特征和特性远不及原本的组织，而伤口再生的目标是用与原本组织完全一样的组织来重建受损组织，以恢复受损组织的形态以及功能。
伤口愈合的过程通常可分为3/4个相互重叠的阶段：止血（Haemostasis）/炎症期（Inflammation）、细胞增殖（Proliferation）和重构（Remodeling），受到多种细胞、细胞因子和生长因子的调控。
有多种生长因子、细胞因子、整合素、角蛋白、基质金属蛋白酶、趋化因子、和细胞外大分子参与和调节复杂的伤口愈合过程。下表所列为伤口愈合过程中涉及的生长因子。
3. 生长因子在伤口愈合过程中的作用
生长因子在伤口愈合和组织再生中发挥了不可或缺的作用。信号传导蛋白影响着其他细胞的代谢。每种生长因子对于伤口愈合过程有超过一种效应，其通过与靶细胞膜表面特定受体结合而发挥作用。这些作用包括促进趋化性（吸引细胞至伤口部位）、刺激细胞迁移和增值、刺激细胞上调蛋白质生产。这些生长因子不仅调节细胞迁移和增值，而且能重构细胞外基质和促进血管生成，为皮肤伤口愈合创造理想的环境。
通过血小板α颗粒的脱颗粒，PRP能分泌多种不同的生长因子，包括PDGF、VEGF、FGF、HGF和TGFβ（表2）。
表2: 伤口愈合过程中涉及的生长因子及其来源
PDGF: 血小板来源生长因子; VEGF: 血管内皮生长因子; FGF: 成纤维细胞生长因子; HGF: 肝细胞生长因子; TGF: 转化生长因子
血小板所含的主要生长因子
目前已知参与伤口愈合过程的主要生长因子是PDGF、EGF、FGF、IGF、VEGF、TGFβ、HGF、KGF。接下来我们将描述不同生长因子在伤口愈合过程中的作用。
4. 富含血小板血浆（PRP）：制备方法和治疗配方
PRP可以被定义为是从全血中所提取的含有高浓度血小板的部分血浆，因而其所含生长因子浓度亦很高。当前，PRP被广泛用于不同的临床应用，包括骨科愈合、软组织愈合、神经组织、慢性皮肤溃疡、眼科、和牙科。PRP被美国FDA界定为是人为干预极少的组织，属于自体血液制品。其优势之一是易于从患者自身血液获取，因而安全、简便和性价比高。通过控制离心参数和激活方式，可以控制激活后释放的生长因子和蛋白质的剂量。
目前还没有PRP制备的金标准，也缺乏法规和标准。为了描述在组织再生中发挥关键作用的主要成分的特征和为特定的病理生理情况准备足够的制剂，良好设计的简单流程是必需的，其中离心条件对于获得高质量的PRP是基础。
近年来对于PRP的命名和定义有很大的争议。有人认为术语“富含血小板血浆（PRP）”较为模糊和不准确。临床所用的大量的自体血液制品在制备方法上有所差别，因而其定量和定性特征亦不同。因此，一份详细的、准确的和分布描述的PRP制备方案（离心条件、血小板浓度、抗凝剂类型、血小板激活剂和是否包含白细胞）对于不同研究间的比较是必要的。此外，保护血小板的完整性和质量、防止血小板损伤或溶解以使其能完全释放生长因子是很重要的。
基于上述原因，生物技术学院（BTI）开发了一种先进的自体PRP系统，制备富含生长因子血浆（Plasma Rich in Growth Factors, PRGF），被称为PRGF-Endoret。PRGF是一种自体血液产品，含有中等浓度的血小板，无白细胞，可提供由纤维蛋白形成的支架供细胞粘附，从而帮助伤口愈合。接下来我们将介绍几种不同的PRP制备方法。
4.1. 制备方法
当前PRP制备方法的技术细节上有所差别，例如是否包含白细胞或红细胞、离心的速度和时间。尽管结果似乎是类似的。
Anitua（2004）认为不应该包含白细胞，因为他们会改变某些GFs的功能和干扰抗炎作用。其他，如Harvest技术公司声称这些细节不重要，其PRP产品含有一些红细胞。此外，有研究人员在治疗溃疡或其他手术时偏爱将白细胞纳入，认为其有抗菌作用。
4.1.1. PRGF系统（BTI Biotechnology Institute, Vitoria, Spain）
有临床价值的PRP所含血小板浓度至少为1百万/微升。Anitua认为PRGF是对这种再生治疗的更准确的术语，必须含有相较于全血中1.5倍的血小板浓度。PRGF的主要优势包括：生物相容性、多用途和安全；不存在白细胞阻碍促炎效应；标准化的血小板激活方法（使用氯化钙）来释放生长因子；制备方法简单快速，只需一次离心（460g，8分钟）；有抑菌特性和强大的治疗潜力，无副作用【99】。单次离心后，红细胞沉淀于管底，其上层为白细胞，再上层为血浆，可分为上部60%（生长因子浓度低）和下层40%（PRGF）（图2）。
图2: PRGF制备。A：无菌条件下收集血液于含有枸橼酸钠的离心管中，460g离心8分钟；B：血液被分离为3部分：主要含有血小板的血浆（最上层）、白细胞层即棕黄层（中间层）、红细胞层（下层）；C：层流净化罩中进行移液；D/E：将血浆层上部（GFs含量低）和下部（GFs含量高）移至单独的分馏管中，无添加剂；F：加入PRGF激活物（氯化钙，50µL/ml制备液）以实现血小板脱粒和释放生长因子。
4.1.2. 血小板浓缩采集系统（PCCS Kit）（3i-Implant Innovations，Palm Beach Gardens，FL，USA）
该技术获得的血小板浓度为110至220万/µL，并且包含白细胞（5500-14800/ µL）。抗凝剂使用ACD-A9，经过2次离心：首次3分钟45秒，3000rppm；第二次3000rpm，13分钟。
4.1.3. 重力血小板分离（GPS System）（Biomet Merck Biomaterials，Darmstadt，Germany）
使用该方法，获得的血小板浓度可达160万/µL，所含白细胞浓度为31100/µL。使用60mL注射器，含有6mL抗凝剂（ACD-A）和54mL患者血液。血液在GPS管内离心12分钟，3200rpm。
4.1.4. 智能PReP系统（Harvest Technologies Corpopration，Munich，Germany）
该方法所需血液量为：女性52mL，男性48mL。采用两次离心，获得PRP血小板浓度约125万/µL，白细胞浓度19261/µL。
血液分离的方法有很多，其目的均为获得富含GFs的血浆（表3）。然而，成功需要克服多个挑战，例如完整描述血小板释放的生长因子和蛋白质、评估造成某些产品效果优于其他产品的个别原因。
表3: PRP制备方法和主要特征
4.2. 治疗配方
一个使得PRGF技术区别于其他PRP产品的重要特征是其多功能性。从患者血液可以获得四种不同配方的PRGF，拥有很强的治疗效果，赖于样本抗凝和激活程度的不同，配合满足不同临床需求。该治疗配方涉及：PRGF上清，用于传统的滴眼液和细胞培养基；液体PRGF，一般用于手术和牙科植入物表面；支架样PRGF（凝块），由纤维和细胞组分构成，常用于皮肤溃疡；弹性和致密纤维膜，对于软组织损伤和封闭手术伤口是极佳选择（图3）
图3: PRGF治疗配方。A：液体PRGF治疗犬皮肤溃疡；B：支架样PRGF与松质骨的混合物；C：PRGF纤维膜治疗创伤性伤口。
5. 使用PRP治疗皮肤伤口
过去数十年中，新的细胞疗法如PRP在各种不同疾病的应用得到了越来越多的关注。医学领域的发展趋势是开发微创和性价比高的治疗方法来促进功能恢复。PRP的使用对于减少标准医疗的经济成本有潜在影响，尽管不应考虑将其作为某些必要传统治疗（如坏死组织清创）的替代方法，而应作为补充治疗。PRP治疗能为受伤区域提供某些信号传导细胞因子和生长因子，这些因子通过调节炎症、刺激血管生成和新生组织的形成和重构，在组织修复过程中扮演关键作用。PRP用于皮肤伤口愈合的其他优势包括：方法简单、性价比高、与传统治疗相比效果更持久、作为自体产品而具有安全性。
PRP治疗过程
PRP在人体和动物的应用稳步增加，其促愈特性在很多临床和实验室研究中有所报道。血小板因其止血功能和含有高浓度的生长因子和细胞因子而在伤口愈合过程中发挥重要作用。高浓度的生长因子能促进表皮和内皮细胞再生、刺激血管生成和胶原蛋白沉积、和加速愈合过程。PRP首次临床应用是用于慢性下肢溃疡治疗，研究中观察到PRP刺激血管化的结缔组织形成【122】。
人体临床试验中PRP的主要应用与慢性疾病相关，例如糖尿病溃疡，该病中伤口愈合受损，由于促炎和抗炎细胞因子的失衡、低生长因子浓度或过多的活性氧而表现为持续的炎症状态。在此意义上来说，生长因子和细胞因子在控制氧化损伤方面发挥了关键作用。PRP中生长因子的再生能力帮助缩短伤口和各种组织损伤的恢复时间。与上述结论一致，Babaei等对150例塘组溃疡局部使用PRP后观察到健康肉芽组织形成和伤口闭合时间的缩短【124】。使用皮下自体PRP注射加局部PRP凝胶治疗不同病因的难愈溃疡，证实自体PRP治疗难愈溃疡方面的安全性和有效性，不仅伤口尺寸显著减小、无副作用、且损伤部位疼痛和炎症减少【114】。在坏死性软组织感染继发伤口局部使用自体PRP亦取得类似积极结果【125】。此外，Man等研究显示局部应用自体PRP治疗皮瓣后获得皮肤伤口愈合的定量改善【127】。如前所示，几项针对人体慢性伤口治疗的研究显示伤口愈合的改善，表现为伤口面积和体积的减小、以及伤口闭合改善。体外试验中，Roubelakis等【53】研究了PRP对间充质干细胞（MSC）和皮肤成纤维细胞的增殖和迁移特性的作用，证实其对MSC和成纤维细胞的迁移能力和增殖率有显著诱导作用。此外，在真实临床患者中，PRP敷料治疗后显示溃疡愈合加速和受损区域血管新生速度加快。其他研究者在随机、前瞻和回顾研究中亦获得类似结果。因此，与传统方法相比，血小板的应用似乎获得更快的愈合【27,131,132】。对PRP在皮肤伤口中应用的荟萃分析，与对照伤口治疗相比，PRP增强了伤口愈合过程，难愈急慢性伤口显著改善，此外，PRP显示出对金葡菌和大肠杆菌的抗菌活性【99,133】。
PRP在伤口愈合中的应用
PRP的治愈能力依赖于血小板在生理状态下含有多种生长因子，具有很强的愈合功能，在组织再生中发挥重要作用。在动物模型中使用PRP依然是检测新型再生治疗的金标准，亦有助于后续在动物和人体的临床应用。有很多在狗和马的皮肤伤口治疗中使用PRP的体内研究。Farghali等检测了狗全层皮肤伤口周围皮下自体PRP浸润注射的效果【45】。结果显示有显著的伤口收缩和再上皮化率。此外，与对照伤口相比，PRP治疗伤口显示出更高的胶原蛋白沉积、更快的肉芽组织形成和疤痕形成减少（胶原蛋白纤维排列更有序）。PRP刺激I型胶原蛋白和基质金属蛋白酶I，增加细胞周期进展调控因子，以加速伤口愈合。PRP治疗伤口中真皮胶原蛋白有序性的增强可能是因为明胶酶B（MMP-9）的增加，因其似乎对胶原蛋白纤维的装配很重要。与上述研究一致，其他两项在马的伤口完成的临床研究显示出更快的表皮分化和真皮胶原蛋白有序性的增强【【118,139】。近期对于创面内注射PRP治疗狗急性皮肤伤口的研究显示PRP治疗伤口与对照组相比，宏观和微观均表现出更快的愈合，血管生成和肉芽组织形成加强、胶原蛋白沉积增加、再上皮化和表皮分化加速【36】。
研究显示PRP在组织扩增和皮肤增殖中发挥重要作用，因其可以增强细胞增殖、胶原蛋白合成和新生血管形成。有报道PRP与其他治疗联合使用获得更好的结果。Lian等研究显示PRP与骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）有协同效应【151】。同样，Park等研究显示PRP+水凝胶治疗小鼠伤口改善了伤口愈合，显著缩短了愈合期和增强血管生成。Manuka蜂蜜（MH）因其内在促愈能力而为人所知，在一项决定成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞对于添加了MH、PRGF或二者时的培养基的反应，结果显示PRGF+MH的存在增加了细胞活性，成纤维细胞的反应最为积极【153】。
表4: 应用PRP治疗皮肤伤口的一些研究
6. 结论
由于人们对低或无创治疗的青睐，再生治疗已经逐渐成为促进伤口愈合的金标准。作者观点认为PRP可以作为伤口愈合的安全和高性价比治疗方法，借以缩短恢复期，进而改善患者生活质量。
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